硝基咪唑類藥物測定方法——免疫分析法

時間：2023-03-24 23:05:00來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基咪唑類藥物測定方法——免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(7)免疫分析法(immuno analysis，IA)

免疫學檢測方法是基于抗原_抗體反應原理設計的測定藥物殘留的分析方法。免疫分析不需要復雜儀器設備，降低了檢測成本，且靈敏度高，操作簡便快速。目前，硝基咪唑類藥物殘留分析中采用較多的免疫方法主要有酶聯(lián)免疫分析方法和免疫傳感器方法。

1)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化以及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性，讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。

MNZ是一種小分子，本身并不具備免疫原性，必須將其與具有免疫原性的載體蛋白相偶聯(lián)生成完全抗原才具有免疫原性。由于MNZ本身沒有氨基、羥基或羧基等活性基團，需要進行結構改造。Wang等測定動物源食品中硝基咪唑類藥物，首先在堿性條件下將RNZ的2位酯鍵水解生成MNZOH，MNZOH與戊二醛合成MNZ半抗原，分別采用混合酸酐法將半抗原與小牛血清蛋白(BSA)反應生成包被抗原，用碳二亞胺法(EDC)將半抗原與血藍蛋白反應生成免疫抗原，獲得了硝基咪唑類藥物的單克隆抗體，用間接顯色ELISA法檢測硝基咪唑抗體。方法的IC50分別為0.20ng/mL(MNZ)、4.0ng/mL(TNZ)、0.17ng/mL(DMZ)和0.24ng/mL(ORZ)，與MNZ、TNZ、DMZ、RNZ、ORZ和SNZ的交叉反應率分別為100%、5%、121%、82%、16%和20%，與其他結構或功能相似的藥物交叉率很小。在食品中的LOD為0.1ng/mL，檢測雞肉、雞肝和蝦肉中硝基咪唑類藥物的回收率為74.0%～90.6%，CV小于14%。

也可以將硝基還原為氨基后再與蛋白偶聯(lián)。Huet等用水合肼法將MNZ硝基還原成氨基，再用EDC法合成抗原，以避免載體蛋白自身的氨基和羧基在交聯(lián)劑作用下發(fā)生自身交聯(lián)，從而最大限度地減少反應副產物的生成。免疫過程中，在合成抗原的誘導下，機體產生針對載體BSA決定簇和半抗原決定簇的抗體。以此建立了檢測禽蛋和雞肉中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ以及MNZOH等5種硝基咪唑類藥物的ELISA法。樣品用乙腈萃取，正己烷除脂后，ELISA檢測。不同藥物回收率在18%～98%之間；蛋和雞肉中DMZ的LOD分別小于1μg/kg和2μg/kg，MNZ的LOD小于10μg/kg，RNZ和HMMNI的LOD均小于20μg/kg，而IPZ的LOD小于40μg/kg。

2)免疫傳感器(bioimmunosensor)

免疫傳感器由偶聯(lián)抗原/抗體分子的生物敏感膜與信號轉換器組成的，將抗原抗體特異性免疫反應信號轉化為其他信號再進行檢測。硝基咪唑類藥物檢測主要采用光學免疫傳感器，光學免疫傳感器使用光敏元件作為信息轉換器。將涂有抗體的光纖浸入溶液中來檢測溶液里的抗原，溶液中抗原與抗體結合，再將結合了抗體的光纖浸入含有被熒光標記的抗原溶液里，帶有熒光指示劑的抗原會與競爭抗體結合，在光纖的另一端加上光源，將返回一個熒光信號。待測試抗體的濃度越高，就有更多的熒光標記抗原與其結合，返回的熒光信號就越強。Thompson等研制了檢測動物肝臟、腎臟、禽蛋、牛奶和血清中硝基咪唑類藥物的光纖免疫傳感器。通過免疫綿羊MNZ蛋白結合物獲取多克隆抗體，交叉反應表明所獲得的多克隆抗體可以結合至少7種主要硝基咪唑及其代謝物(包括RNZ、IPZ、MNZ、MNZOH、HMMNI和IPZOH)，樣品用乙腈提取離心后直接測定。DMZ的CCβ小于1μg/kg或mg/L。Connolly等也利用硝基咪唑多克隆抗體，制備了可同時測定禽肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH和HMMNI的光纖生物傳感器。DMZ、MNZ和RNZ的CCβ小于1ppb，另外兩種代謝物的CCβ小于2ppb。

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