甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（一）

時間：2023-03-25 04:54:57來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（一）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

8.1.4.1 前處理方法

由于基質復雜，ASs的殘留量極低，再加上樣品提取和純化的過程非常繁瑣，導致最后的回收率較低，使得樣品中ASs多組分殘留的檢測具有一定的難度。不但要求有高靈敏度的檢測方法，而且也需要相應高效的提取和凈化方法。一般固體樣品需要經過粉碎或冷凍干燥均質化后，在適當條件下水解，將結合態的ASs解離出來，然后經有機溶劑提取和凈化后進行分析。

(1) 水解方法

ASs在動物體內常以結合態形式存在，如硫酸酯、葡萄糖醛酸苷等。為提高方法提取效率，必須通過水解使ASs游離出來。水解方法一般有三種:酸解、堿解和酶解。

Rambaud等建立了人頭發中ASs多殘留的氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)檢測方法。樣品經磨碎后在50℃條件下用甲醇提取，用甲醇化鈉(MeONa)和HCl進行酸性水解后，用乙酸乙酯再次提取，再用NaOH中和，GC-MSMS分析。方法定量限(LOQ)可達0.1～10μg/kg，平均回收率為50%。

Kaklamanos等建立了肌肉組織中的20種ASs的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法。樣品用含枯草桿菌的pH9.5 Tris緩沖液進行堿水解，叔丁基甲醚提取，55℃旋轉蒸干，加入甲醇-水(4+1，v/v)渦動混勻，然后采用正己烷除脂，再用OasisHLB和氨基柱分別進行凈化后，LC-MS/MS檢測。該方法檢測限(CCa)為0.03～0.14ng/g，檢測能力(CCβ)為0.05～0.24ng/g。

酶解的作用條件溫和，可避免ASs在強酸、高溫等條件下被破壞，且由于酶的催化活性，水解效率高，被廣泛使用。酶解常采用β-葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶，通常在37℃酶解數小時。Marchand等利用氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測了肉中的ASs。凍干樣品用甲醇-醋酸緩沖液提取后，通過葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶解離待測藥物(52℃孵育15小時，pH5.2)，再用醋酸緩沖液液液分配，過ENVI-Chrom P柱凈化后，分別按酚結構藥物和D4-3-酮類藥物進行衍生化，再用GC-MS分析。該方法測得23種ASs的檢測限(LOD)為5～100ng/kg，其方法學指標符合歐盟標準。

(2)提取方法

ASs殘留的提取主要采用液液萃取(LLE)的方法。近年來，一些新的提取技術，如微波輔助提取(MAE)、加速溶劑萃取(ASE)、超臨界流體萃取(SFE)也開始應用到ASs殘留的提取中。

1) 液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

ASs種類較多，殘留濃度較低(ng/kg～μg/kg)，且樣品基質較為復雜，使殘留分析變得較為困難。一般來說，肉、脂肪、腎臟和肝臟常采用有機溶劑進行LLE提取，同時進行研磨、冷凍干燥和勻質，然后進行多步驟液液分配凈化或固相萃取凈化。一般常以甲醇為提取溶劑，乙腈、乙醚、叔丁基甲醚等也可作為其提取劑。

秦燕等建立了動物肌肉組織中多種ASs的LC-MS/MS分析方法。樣品加醋酸緩沖溶液均質，經酶水解后，再加甲醇超聲提取，用叔丁基甲醚LLE至少兩次后，再用反相固相萃取柱凈化，用LC-MS/MS在多反應監測(MRM)模式下定性及定量分析。該方法測得10種ASs的LOQ為0.5～1.0μg/kg，平均回收率為55%～77%，相對標準偏差(RSD)為7.1%～35%。Blasco等建立了肉中ASs殘留檢測的LC-MS/MS分析方法。樣品經酶解后用甲醇提取，然后用C18和氨基柱固相萃取凈化，結合使用正離子和負離子切換模式進行質譜分析，方法LOD和LOQ都低于0.5ng/g。Vanhaecke等建立了牛肉中34種ASs(10種雌激素、14種雄激素和10種孕激素)殘留的超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。樣品經甲醇勻質，正已烷除脂，乙醚LLE后，采用硅膠柱和氨基柱凈化。UPLC-MS/MS采用大氣壓化學電離源(APCI)在正離子和負離子模式下采集數據。該方法的CCa為0.04～0.88μg/kg，CCβ為0.12～1.9ug/kg，日內變異系數(CV)與日間CV均低于20%，線性關系良好(r>0.99)。

徐錦忠等用乙腈提取了雞肉和雞蛋中的睪酮、甲基睪酮、群勃龍、去氫睪酮、諾龍、美睪酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮和苯丙酸諾龍。超聲提取后用正己烷液液分配除脂，LC-MS/MS在選擇反應監測(SRM)、正離子模式下進行定性及定量分析。方法LOQ為0.5μg/kg，平均回收率為73.4%～108.9%，RSD為3.4%～13.4%。實驗比較了乙腈、叔丁基甲醚和乙酸乙酯的提取效率，發現幾種溶劑的提取回收率相差不大，乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取后脂肪較多，而乙腈提取液中則較少。

曾東平等建立了豬肉中8種性激素(己烯雌酚、甲基睪酮、炔諾酮、17a-乙炔雌二醇、雌二醇、6a-甲基-17a-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇和醋酸氯地孕酮)的GC-MS檢測方法。樣品用乙醚提取，然后使用甲醇-水和石油醚進行液液分配，氮氣吹干提取液后，用水和乙醚進行再次提取，然后用氨基固相萃取柱凈化，再經衍生化反應后進GC-MS分析。8種ASs的平均回收率大于70%，批內CV為2.7%～12%，批間CV為5.9%～12%；LOD和LOQ分別為0.94～1.92μg/kg、3.13～8.03μg/kg。賀利民等在堿性條件下用叔丁基甲醚提取肌肉組織及雞蛋中的11種ASs，經過冷凍離心脫脂凈化后，LC-MS/MS檢測。動物肌肉和雞蛋中睪酮、甲基睪酮、去氫睪酮、美睪酮及康力龍的LOD是0.3μg/kg，回收率是62.3%～105%，RSD為0.5%～15%；群勃龍、諾龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍的回收率大于50%，RSD小于16%。實驗比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚等溶劑或其混合物的提取效果，發現叔丁基甲醚的提取回收率高且易于濃縮。Saeed等在對肉制品中同化激素殘留水平調查中，也采用叔丁基甲醚提取，藥物經免疫親和柱凈化后，GC-MS檢測分析。6種ASs的平均回收率是77%～99%。

2)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是跟索氏提取法類似的一項技術，區別是提取過程中使用超臨界流體作為溶劑，最常用的超臨界流體是二氧化碳。這項技術的主要優點是高擴散率、低黏度和較小的表面張力16。Stolker等將SFE應用于動物組織中醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯睪酮和醋酸美侖孕酮的檢測。采用二氧化碳為超臨界流體，氧化鋁作為吸附劑來提取待檢測化合物。經提取后的激素再進行堿性酶解和衍生化處理，最后上GC-MS分析。方法LOD可以達到2μg/kg，重復性為4%～42%(n=9)，再現性為2%～39%。Din等使用SFE技術提取牛肉中的群勃龍，采用甲醇增加溶解性，并減少基質干擾。用含10%甲醇的二氧化碳在400atm、75℃下提取60min，回收率可達到98%。

3)加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

ASE是利用升高溫度和壓力，增加物質溶解度和溶質擴散速度，提高萃取的效率。與傳統提取方式相比，ASE速度快、溶劑用量少、萃取效率高、待測組分回收率好，可實現全自動安全操作。Hooijerink等采用ASE建立了一種檢測腎脂肪中6種孕激素(醋酸氟羥孕酮、地馬孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、氯地孕酮、醋酸美侖孕酮、醋酸甲羥孕酮)的分析方法。ASE裝置中裝有氧化鋁、無水硫酸鈉和腎脂肪，混合后，用乙腈進行在線提取，再冷凍除去脂肪，C18固相萃取柱凈化，LC-MS/MS進行檢測。該方法的CCa為0.3～0.9ng/g，CCβ小于等于2ng/g，回收率為17%～58%。

4)微波輔助萃取(microwave-assisted extraction，MAE)

MAE可加熱攪拌樣品，有助于提高固體樣品的提取效率。同時，MAE提取時間短，可用于替代索式提取法，但仍其需要其他的提取與凈化步驟。Wang等采用動態微波輔助提取(DMAE)與鹽析液液萃取(SLLE)相結合方法檢測魚組織中9種ASs。該方法提取過程見圖8-3。ASs藥物在微波輔助下采用乙腈-水提取，乙腈-醋酸銨溶液中進行分配，LC-MS/MS檢測。該方法的LOD為0.03～0.15ng/g，回收率為(75.3%±4.9%)～(95.4%±6.2%)。

圖8-3 動態微波輔助提取(DMAE)-鹽析液液萃取(SLLE)裝置流程圖

A.盛溶劑(乙腈或水)容器:B.微波；C.萃取容器；D.真空泵；E.真空閥；F.收集管；G真空SPE管；H.流速控制閥

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