甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（二）

時間：2023-03-25 04:52:32來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3) 凈化方法

為了去除或減少生物樣品中的脂肪、蛋白質等其他雜質，并濃縮分析物，提高分析靈敏度，初步提取出來的樣品溶液通常需要進一步凈化。常見的凈化方法包括液液分配(LLP)、固相萃取(SPE)、免疫親和色譜(IAC)和凝膠滲透色譜(GPC)等。

1) 液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP是一-種初級的凈化技術，根據目標物在互不混溶的液體間的溶解度不同，達到富集分離凈化效果。雖然LLP需要用大量的有機溶劑，萃取時間長，分離效率低，萃取過程易乳化或沉淀，但仍然在殘留分析中廣泛應用。目前，LLP已經從簡單的一步溶劑萃取發展到用復雜的多相分配體系提取和凈化分析物。

江潔等建立了水產品中多種激素的高效液相色譜法(HPLC)。在樣品處理方法上，魚肉采用乙醚進行均質處理后超聲振蕩，水浴減壓蒸干提取液后，加入甲醇進行溶解，再利用石油醚進行LLP萃取脂溶性雜質，離心去除石油醚層，再次蒸干甲醇溶液，加入一定量的水清洗后進行乙醚反萃取，最終濃縮后上樣。通過回收率、相對標準偏差的評價，該方法對雌二二醇、睪酮、甲基睪酮及孕酮的測定準確可靠，回收率大于70%，RSD為1.27%～6.92%，LOD為0.05～0.1ug/mL。Vanhaecke等利用甲醇提取牛肉中的34種ASs，正己烷脫脂后再使用二乙醚進行LLP，最后用硅膠柱和氨基柱進行凈化。方法LOD可達到0.04～0.88μg/kg，LOQ為0.12～1.9μg/kg。Zeng等建立了豬組織中8種ASs的GC-MS檢測方法。樣品經乙醚提取，渦動混勻后離心，氮吹蒸干，加入甲醇-水(4+1，v/v)和石油醚，渦動混勻后離心，旋轉蒸干至終體積為0.5mL，再加入水，用石油醚進行提取，氮氣吹至終體積為0.5mL，然后用氯仿和甲烷進行溶解，硅膠和氨基柱進行凈化。在2.5～50μg/kg的添加濃度范圍內，方法回收率可達67.7%～120%，批內CV為0.4%～12%，批間CV為6.4%～11%。林奕芝等采用GC-MS測定肉中雌二醇、戊酸雌二醇、炔雌醚和苯甲酸雌二二醇的殘留量。樣品用乙腈超聲提取，提取液經二氯甲烷反萃取后濃縮至干，殘留物經固相萃取柱凈化后，再進行衍生化反應，在選擇離子監測(SIM)模式下用GC-MS測定。該方法4種組分分離較好，LOD小于等于20ng/g，回收率為84.6%～92.4%，CV小于或等于1.2%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是一種由液固萃取和柱色譜技術結合形成的樣品前處理技術，具有分離效率高、選擇性好、有機溶劑用量少，易與各類檢測方法聯用等優點。ASs殘留分析常用的SPE柱種類有C18、HLB、氨基、硅膠、氧化鋁、石墨化碳黑(GCB)、氰基柱以及復合用柱等。

A.C18柱

王煉等采用酶水解-HPLC法測定肉及牛奶中的11種ASs。碎肉用乙腈超聲提取，水浴蒸干后加入KH2PO4緩沖液(牛奶直接加入KH2PO4緩沖液)，再加β-葡萄糖醛酸酐酶，37℃恒溫水解24h，用KH2PO4緩沖液稀釋后過ENVI-18 SPE柱，乙腈洗脫，HPLC檢測。11種激素的LOD為0.009～0.020mg/kg，平均回收率為51%～107%，RSD為0.77%～6.42%，相關系數為0.9995～0.9999。Xu等用反相C18柱純化富集了肌肉組織中的10種ASs。甲醇和水進行活化后上樣，10%的甲醇溶液淋洗，最后用甲醇洗脫，濃縮后上LC-MSMS分析。方法平均回收率范圍為70%～89%，CV為7.1%～19.1%；LOD為0.06～0.22μg/kg，LOQ為0.12～0.54μg/kg。班付國等用乙酸乙酯提取水產品中的群勃龍，提取液氮氣吹干，加入20%甲醇溶液溶解，再進行C18柱凈化。C18柱用3mL甲醇、3mL水活化，用3mL 40%甲醇溶液淋洗，吹干，用3mL甲醇洗脫，洗脫液氮氣吹干，殘留物加80%甲醇溶液0.5mL溶解，過膜后供LC-MS測定。不同基質中，群勃龍在2～100ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性相關，相關系數在0.994以上，回收率為74.2%～119%，批內CV為1.0%～9.0%，批間CV為0.3%～8.5%。

B.氨基柱

張鴻偉等建立了同時檢測肌肉中16種ASs的液相色譜-四極桿/離子阱質譜(LC-Q/Trap-MS)方法。肌肉中的ASs采用乙腈超聲輔助提取，正己烷脫脂，二氯甲烷-甲醇(8+2，v/v)定容后經氨基SPE柱凈化。將定容后的提取液加載至氨基SPE上，收集流出液，然后用二氯甲烷-甲醇(8+2，v/v)進行洗脫，合并流出液和洗脫液，氮氣吹干，LC-Q/Trap-MS檢測，內標法定量。結果表明，16種ASs線性關系良好(r≥0.999)，LOQ為0.029～0.36ug/kg，3個添加水平(0.5ug/kg、2.0ug/kg和20μg/kg)下的回收率為89.9%～118%，RSD為6.3%～16.2%。

C.氰基柱

Impens等建立了快速檢測腎脂肪中ASs殘留的GC-MS/MS方法。乙腈提取液中加入正己烷除脂，氮吹蒸干，加入10mL正已烷溶解，依次加入2.5mL 0.1mol/L NaOH和1.25mL 1.0mol/L mgCl2進行皂化，60℃孵育30min，3000r/min離心5min，將上清液旋轉蒸干。加入2.5mL正己烷復溶，然后經氰基柱凈化。氰基柱用乙酸乙酯、正已烷平衡，上樣，正己烷淋洗，乙酸乙酯-正己烷(90+10，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干，分析物經三甲基硅醚衍生化后，GC-MS/MS檢測。方法LOD為2～50ug/kg，CCa為1～6μg/kg，CCβ為2～10μg/kg。

D.硅膠柱

Marchand等采用GC-MS檢測肉中的超痕量ASs。醋酸鹽緩沖液(提取液)中加入葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，52℃酶解15h(pH5.2)，再轉移至硅膠SPE柱凈化。SPE柱已經乙酸乙酯、甲醇、水活化，正己烷淋洗干擾物，正已烷-乙醚(70+30，v/v)洗脫，洗脫液旋轉蒸干，衍生后，用GC-MS測定。該方法測得23種ASs的LOD為5～100ng/kg。

E.氧化鋁柱

Rejtharova等開發-種用于測定動物脂肪組織中6種ASs(四烯雌酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美侖孕酮、乙酰氧基和氯地孕酮乙酸酯)殘留的檢測方法。采用甲醇提取，待提取液旋轉蒸干后，加入2mL甲苯-正已烷(5+9，v/v)溶解。采用氧化鋁柱凈化，上樣后，氧化鋁柱依次用5mL甲苯-正己烷(5+9，v/v)、10mL甲苯和5mL甲苯-乙醇(99+1，v/v)淋洗，分析物再用甲苯-乙醇(99+1，v/v)洗脫，洗脫液于40℃下旋轉蒸干。加入0.5mL甲醇-水溶液(6+4，v/v)超聲溶解，0.2um濾膜過濾后LC-MS/MS測定。該方法已按照2002/657/EC進行驗證，LOD范圍在0.3～1.7ng/g之間，回收率為80%～105%。

F.交聯葡聚糖柱

林奕芝等采用GC-MS測定肉中雌二醇、戊酸雌二醇、炔雌醚和苯甲酸雌二醇的殘留量。樣品用乙腈超聲提取，經二氯甲烷反萃取后濃縮至干，殘留物經交聯葡聚糖LH-20柱凈化，共負荷3次，總量約0.4mL，然后洗提。棄去最先的4.5mL洗提液，分取后面5mL，氮氣濃縮至干，衍生化反應后，GC-MS在SIM模式下測定。該方法LOD小于等于20ng/g，回收率為84.6%～92.4%，CV小于或等于1.2%。

G.復合用柱

在ASs殘留凈化中復合用柱應用也比較多。

Schmidt等建立了LC-MS/MS方法測定牛肉中ASs。樣品經過Tris堿化處理后進行酶解16h，然后用叔丁基甲醚進行提取，取有機層濃縮至干后用甲醇-水進行復溶，再用正已烷LLP除脂，然后SPE凈化。首先過HLB柱，HLB柱用5mL甲醇和5mL水活化，上樣后，用5mL水和5mL甲醇-水(40+60，v/v)淋洗，5mL丙酮洗脫，收集洗脫液。再用氨基柱凈化，氨基柱經5mL甲醇和5mL丙酮活化，將HLB柱洗脫液上樣，收集流出液進行濃縮，復溶于乙腈-水中。該方法的CCa為0.15～0.79μg/kg，CCβ為0.19～1.10μg/kg，平均回收率為96.0%～104.5%。Kaklamanos等建立了牛血清中12種ASs的LC-MS/MS檢測方法。血清樣品經過蛋白沉淀后，選擇HLB柱和氨基柱分別進行凈化處理。HLB柱用甲醇-水(40+60，含2%氨水，v/v)和水淋洗，然后用丙酮-甲醇(80+20，v/v)進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液直接經氨基柱凈化，收集流出液，濃縮至干，復溶于甲醇后上樣。方法LOQ為0.02～0.12ng/mL，LOD為0.01～0.07ng/mL，回收率為70.2%～118.2%。Kaklamanos等還建立了肌肉組織中的20種ASs的LC-MS/MS檢測方法。樣品用堿水解，叔丁基甲醚提取，除脂后，用HLB和氨基柱分別進行凈化。HLB柱用甲醇、水活化，分別用2%氨水溶液(含5%甲醇)、2%氨水溶液(含40%甲醇)淋洗，丙酮-甲醇(80+20，v/v)洗脫，收集洗脫液。洗脫液直接過氨基柱，收集流出液，氮氣吹干。該方法LOD為0.03ng/g，LOQ為0.05～0.24ng/g，回收率為78.7%～119.4%。

Galarini等利用C18-氨基串聯柱純化了尿液中的諾龍。C18柱用甲醇和水進行柱前活化，45%的甲醇溶液進行洗滌，同時將串接在C18柱下的氨基柱進行活化，以乙酸乙酯洗脫氨基柱中的分析物，氮氣吹干后，復溶于乙酸乙酯后再進行衍生化，最后進行GC-MS/MS分析。該方法的LOQ為1.9μg/L，LOD為1.5μg/L，回收率為90%～110%。

Yang等建立了一種檢測豬肉、牛肉、蝦肉、牛奶和豬肝中50種ASs的UPLC-MS/MS殘留方法。樣品經酶解，甲醇提取后，加入超純水稀釋，然后采用GCB柱凈化，GCB柱依次用6mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)、甲醇、水進行活化，上樣后，用1mL甲醇淋洗，真空泵抽干，接著用氨基柱凈化，氨基柱用4mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)進行活化，直接放在GCB柱下，用8mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)進行洗脫，將洗脫液氮吹至干，分析物加入1mL甲醇-水(1+1，v/v)復溶后，用UPLC-MS/MS分析。方法LOQ為0.04～2.0ug/kg，平均回收率為76.9%～121.3%，RSD為2.4%～21.2%。

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