硝基咪唑類藥物殘留分析技術——凈化方法（一）

時間：2023-03-24 23:42:09來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基咪唑類藥物殘留分析技術——凈化方法（一）

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(2)凈化方法

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP凈化是利用待測物與雜質在互不相溶的兩相溶劑中溶解度和分配系數的差異進行的凈化。待測物和雜質之間如果有較大極性差異或隨著溶液系統pH的變化極性有明顯改變時，常選用LLP。LLP遵循相似相溶原則，選擇好兩相溶劑，充分利用水相pH的調節作用使待測物成游離離子態或結合成中性有機分子，以提高提取效率。本類藥物的堿性性質常用作LLP凈化的基礎。在中性和堿性條件下，硝基咪唑類藥物呈分子狀態，易于由水相轉入有機相，清除水溶性雜質；而在酸性條件下，藥物呈離子狀態，易于由有機相轉入水相，清除脂溶性雜質。因此，硝基咪唑類藥物LLP凈化中常通過調節溶劑酸堿性轉移藥物和清除雜質。液液分配雖然操作方便，但也存在缺點，即需要大量有機溶劑進行多次萃取，而且易乳化，影響回收率，特異性較差。

Shen等用乙酸乙酯提取豬組織中MNZ、DMZ、DMZOH和RNZ，提取液吹干后用稀鹽酸-正己烷LLP去除脂溶性物質，HPLC測定。LOD為1.0～2.0μg/kg；肌肉中的平均回收率為80.1%～83.9%，肝臟組織為78.9%～82.3%。高小龍測定雞組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)中MNZ和DMZ殘留，用二氯甲烷提取，吹干后，用水-正已烷LLP脫脂，HPLC測定。DMZ及DMZOH的LOQ均為1μg/kg；肌肉中的平均回收率在56.9%～76.5%之間，肝臟在63.3%～72.6%之間，腎臟在64.2%～73.3%之間，脂肪在63.5%～75.7%；日內CV均小于16%，日間CV均小于18%。Sorensen等用乙腈和正己烷提取魚肉中的MNZ和MNZOH，用正已烷脫脂，將殘留物轉移至乙腈相，HPLC測定。魚肌肉中2種藥物的LOD均為2.8μg/kg，魚皮中MNZ的LOD為3μg/kg，MNZOH為5μg/kg；MNZ絕對回收率為93%～81%，MNZOH為79%；CV分別為3.3%和3.2%。黎翠玉等測定豬肉、雞肉和魚肉中MNZ、DMZ和RNZ三種硝基咪唑類化合物及兩種代謝物MNZOH、HMMNI殘留。乙酸乙酯提取液蒸干后，用甲醇和正己烷LLP除脂，LC-MS/MS測定。回收率在61.1%～108.0%之間，RSD為1.9%～6.3%，LOQ為0.1μg/kg。Gaugain等用二氯甲烷提取豬、禽組織中3種硝基咪唑類藥物，提取液蒸干，用乙酸銨緩沖液-正己烷LLP脫脂，再用SPE凈化，高效薄層色譜(HPTLC)測定。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分別為2μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。GB/T21318-2007測定動物組織樣品中RNZ、IPZ、MNZ、DMZ、ORZ、4-硝基咪唑、CMNI、苯硝咪唑等8種硝基咪唑和2種代謝物MNZOH、HMMNI殘留。用飽和氯化鈉-甲醇-丙酮提取后，蒸干有機相，加入乙酸乙酯與氯化鈉溶液LLP凈化，LC-MS/MS測定。LOD為0.5～1μg/kg，回收率為71.4%～115%。

Cronly等測定禽蛋中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ和羥基化代謝物MNZOH、HMMNI、IPZOH。禽蛋用乙腈提取，提取液用氯化鈉沉淀雜質，用正已烷與乙腈LLP脫脂，LC-MS/MS測定。CCa為0.33～1.26μg/kg，CCβ為0.56～2.15μg/kg，回收率為87.2%～106.2%。

高小龍測定蜂蜜和蜂王漿中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ殘留。蜂王漿用鹽酸溶解，氯化鈉沉淀雜質，正已烷去脂；蜂蜜樣品僅用鹽酸溶解稀釋，取上層酸液加磷酸氫二鉀15g，用二氯甲烷萃取，鹽酸反萃取，過SCX SPE柱，用0.5mol/L的磷酸氫二鉀溶液(pH8.8)洗脫，洗脫液再萃取至二氣甲烷，HPLC檢測。通過調節酸堿性，在水相和有機相多次轉移，達到凈化效果，缺點是較為繁瑣。蜂蜜和蜂王漿中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均為1.0μg/kg；平均回收率分別為59.2%～7.06%和54.9%～69.1%；CV小于18%和16%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品基質和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的，其原理與液相色譜類似。與LLP相比，SPE具有使用有機溶劑較少，速度快，可實現自動化，不會發生乳化，凈化后殘留的雜質相對較少等優點。硝基咪唑類藥物屬于中等極性，屬于堿性化合物，提取液中除分析物以外常含有很多共提物，為了除去這些干擾物，需要進一步采用SPE凈化。在凈化中常用的SPE柱有C18、HLB、硅膠、SCX、MCX、Extrelut NT20和XTR等。

A.陽離子交換柱

陽離子SPE柱是本類藥物最常用的凈化工具，主要采用SCX和MCX柱。

SCX為強陽離子交換柱，質子化的藥物分子通過與小柱.上苯磺酸基團相互作用而被保留。SCX對硝基咪唑類藥物離子互作力遠大于非極性互作力，允許強洗滌溶劑凈化。使用SCX柱，則要溶于酸性水相上樣，洗脫液選用5%氨水-乙腈溶液，或乙酸乙酯洗脫。Lin等測定豬肌肉中5種硝基咪唑類藥物，用SCX凈化。乙酸乙酯提取液蒸干后用乙酸-乙酸乙酯(1+19，v/v)復溶后上樣，依次用丙酮、甲醇、乙腈淋洗，最后用氨水-乙腈(1+19，v/v)洗脫，毛細管電泳(CE)檢測。LOD為0.3～1.0μg/kg，LOQ為0.9～3.2μg/kg；日內回收率為85.4%～96.0%，CV為1.3%～3.9%；日間回收率為83.5%～92.5%，CV為1.1%～4.2%。Sun等用乙酸乙酯提取禽和豬肉中的MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ和DMZOH，提取液上scx柱凈化，依次用丙酮、甲醇、乙腈淋洗，用氨水-乙腈(5+95，v/v)洗脫。7種藥物的LOD為0.2μg/kg，回收率為71.4%～99.5%。Sams等測定禽蛋中硝基咪唑殘留。乙腈提取液用乙酸酸化后用SCX凈化，依次用丙酮、甲醇和乙腈淋洗，用乙腈-35%氨水(95+5，v/v)洗脫，HPLC測定。LOD為0.5μg/kg；禽蛋中回收率分別為65%(DMZ)、87%(RNZ)和75%(MNZOH)。高小龍采用HPLC測定蜂蜜和蜂王漿中的RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ。樣品提取液經鹽酸反萃取后，上SCX柱凈化，用3mL水淋洗，除去水溶性物質，最后采用20mL pH8.8的0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫。蜂蜜和蜂王漿中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均為1.0ug/kg，回收率為59.2%～70.06%和54.9%～69.1%，CV分別小于18%和16%。

MCX柱為反相與強陽離子交換混合保留機制的SPE柱。Xia等用MCX柱凈化豬腎組織中4種硝基咪唑及其代謝物(MNZ、HMMNI、MNZOH、RNZ、IPZ、IPZOH、DMZ)的乙酸乙酯提取液。提取液蒸干后用鹽酸復溶，上MCX SPE小柱，依次用0.1mol/L鹽酸，甲醇和5%氨水淋洗，用含5%氨水的甲醇-水(70+30，v/v)洗脫。平均回收率為83%～111%，CV小于12%，LOD和LOQ分別為0.05～0.5μg/kg和0.1～0.5μg/kg。研究發現，改善凈化條件也可以降低基質效應，在MCX凈化中，洗滌步驟增加2%(v/v)氨水-10%(v/v)甲醇溶液，洗脫步驟增加2%(v/v)氨水-30%(v/v)甲醇溶液可明顯降低基質效應。王揚等同時測定魚肌肉中MNZ、DMZ、ORZ、TNZ和RNZ等5種硝基咪唑類藥物殘留。提取液過MCX柱，3.0mL水洗柱，3.0mL 2%濃氨水甲醇溶液洗脫。5種硝基咪唑類藥物的LOD均為1.0μg/kg，回收率分別為73.3%、74.7%、62.9%、74.4%和80.1%，RSD不大于10%。

B.陰離子交換柱

陰離子交換SPE也有用于硝基咪唑類藥物凈化的報道。GB/T20744-2006測定蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ殘留，乙酸乙酯提取液濃縮后，過Carboxylic acid SPE柱凈化，依次用乙酸乙酯和乙腈洗滌，用甲醇-乙腈-0.1%甲酸溶液(40+18+42，v/v)洗脫。MNZ的LOD為0.1μg/kg，DMZ和RNZ為0.2μg/kg；回收率為69.5%～82.4%。

C.正相柱

用正相SPE柱凈化硝基咪唑類藥物也能起到良好效果。常用的填料主要有硅膠、氨基和硅藻土。Cannavan等建立了DMZ的殘留分析技術。肌肉用二氯甲烷提取，雞肝臟和禽蛋用甲苯提取，提取_上清液直接上硅膠柱凈化，二氯甲烷提取液用甲苯淋洗，甲苯提取液依次用二氯甲烷、正已烷淋洗，丙酮洗脫，液質聯用儀分析。DMZ內標校正回收率為93%～102%，CV為1.2%～7.7%，絕對回收率約80%。Sakamoto等測定魚肉和蜂蜜中的DMZ、MNZ和RNZ，乙酸乙酯提取液蒸干后用乙酸乙酯-正己烷(3+7，v/v)復溶，用硅膠柱凈化，乙酸乙酯洗脫。平均回收率為91.21%～107.0%，CV為1.7%～17.1%，LOD為0.05～0.2μg/kg。Sorensen等將魚肉中MNZ和MNZOH的乙腈提取液蒸干后，復溶于乙酸乙酯-正己烷溶液(1+2，v/v)中，過硅膠小柱凈化，乙酸乙酯-正己烷(1+2，v/v)淋洗，甲醇-乙酸乙酯(1+9，v/v)洗脫。MNZ回收率為81%～93%，MNZOH回收率為79%。氨基柱與硅膠柱凈化機制相似，分別通過藥物的極性基團與氨基或硅醇基相互作用達到保留，但組織中微量的水分對方法的精密度和重復性具有較大影響，因此在凈化前加入無水硫酸鈉脫水非常關鍵。Ho等用甲苯提取肌肉、肝臟和腎臟中的MNZ和DMZ，提取液用等體積正已烷稀釋后，上氨基固相萃取柱凈化，用正己烷淋洗，乙酸乙酯～異丙醇(9+1，v/v)洗脫，氣相色譜-質譜(GC-MS)測定。回收率為72%～106%，CV小于13%。DMZ的蒸汽壓較高，旋轉蒸發和氮氣吹干DMZ隨溶劑揮發而損失，為防止吹干時DMZ被溶劑帶走，考察了DMF、甲酸、三氟乙酸等3種溶劑和蒸發溫度對DMZ的保護效果，表明加入保護劑三氟乙酸和二甲基甲酰胺或者蒸發溫度降低時，DMZ的回收率增高。三氟乙酸可做保護劑的可能原因時它與DMZ發生反應生成較難揮發的鹽。Zhou等分析蜂蜜中的MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI，提取液蒸干后用乙酸乙酯-正己烷(2+1，v/v)復溶，氨基柱上加2g無水硫酸鈉用于脫水，上樣后直接用甲醇-乙酸乙酯(1+4，v/v)洗脫，洗脫液蒸干后用流動相溶解測定。方法LOD為1～2μg/kg，平均回收率在71.5%～101.4%之間。研究還發現，上樣溶液中加入非極性溶劑-正已烷，可提高藥物與極性固定相的相互作用，增加凈化效果和回收率。

Extrelut NT20和XTR的填料是硅藻土(Celite顆粒)，屬于正相SPE柱，也可以用于本類藥物凈化。Polzer等應用Extrelut NT20柱凈化畜禽肌肉提取液中的DMZ、RNZ、MNZ、IPZ、HMMNI、MNZOH和IPZOH。水溶液上樣后，用乙酸乙酯-叔丁基甲基醚(1+1，v/v)洗脫。DMZ、RNZ、HMMNI、MNZ和MNZOH的CCa為0.65～2.8μg/kg，IPZ和IPZOH的CCa為5.2～5.3μg/kg；回收率在96%～118%之間。該凈化的特點為，所有的脂溶性化合物從水溶液中提取出來進入有機相，而水相則保留在固定相上，流出液無乳化，直接蒸發后用于下一步的分析。

D.反相柱

反相SPE也可以用于硝基咪唑類藥物凈化，常用的SPE柱有HLB和C18。

Mottier等測定雞肉和禽蛋中的硝基咪唑類藥物，乙腈提取液蒸干后用水復溶，上HLB柱，用3mL水-甲醇(95+5，v/v)淋洗，甲醇洗脫，LC-MS/MS測定。DMZ、RNZ、MNZ、IPZ、DMZOH、MNZOH和IPZOH的CCa在0.12～1.0μg/kg之間，CCβ在0.22～1.0μg/kg之間。Shen等用乙酸乙酯提取，蒸干后用鹽酸溶解，與正己烷LLP脫脂，鹽酸溶液上HLB柱凈化，甲醇洗脫，HPLC測定。DMZOH、MNZ、RNZ和DMZ的LOD在1.0～2.0μg/kg之間；豬肉的平均回收率為80.1%～83.9%，豬肝為78.9%～82.3%。

高小龍建立了測定雞可食組織中DMZ和DMZOH殘留的HPLC法。雞組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)勻漿后，用無水硫酸鈉和二氯甲烷振蕩提取，取有機層濃縮，加水溶解，用正己烷去脂，水層過C18柱，甲醇洗脫，HPLC在320nm檢測。DMZ和DMZOH的LOQ均為1μg/kg；肌肉的平均回收率在56.9%～76.5%之間，肝臟在63.3%～72.6%之間，腎臟在64.2%～73.3%之間，脂肪在63.5%～75.7%；日內CV均小于16%，日間CV均小于18%。Gaugain等用C18 SPE凈化豬、禽組織中3種硝基咪唑類藥物，用5mL乙酸銨緩沖液淋洗，用2mL乙酸銨緩沖液-甲醇(1+3，v/v)洗脫，HPTLC測定。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分別為2μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。

3)凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)

GPC是基于體積排阻的分離機理，通過具有分子篩性質的固定相，相對分子質量大的組分先流出(即淋洗時間短)，相對分子質量小的后流出(即淋洗時間長)，達到凈化目的。我國國家標準GB/T21318-2007測定豬肉、雞肉、牛肉、豬肝、雞肝、牛肝、豬腎、牛腎和魚肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代謝物MNZOH、HMMNI殘留時，取5mL提取液用GPC進行凈化。凈化柱為GPC Bio Beads SX3(700mm×25mm)，流動相為乙酸乙酯～環已烷(1+1，v/v)，流速為4.7mL/min，棄去先留出90mL淋洗液，再收集接下來90mL流出液，最后再用30mL收集，蒸干后，用甲醇溶解再進一步用C18小柱凈化，LC-MS/MS測定。方法LOD在0.5～1μg/kg之間，回收率為71.4%～115%。

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