糖皮質(zhì)激素類藥殘留分析技術(shù)——前處理方法（一）

時(shí)間：2023-03-25 02:34:54來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

糖皮質(zhì)激素類藥殘留分析技術(shù)——前處理方法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

10.1.4 殘留分析技術(shù)

10.1.4.1 前處理方法

(1)水解方法

由于GCs會(huì)與內(nèi)源性的葡萄糖醛酸結(jié)合，以結(jié)合態(tài)形式存在于生物基質(zhì)中，在分析GCs殘留時(shí)，常需要使用酶水解樣品，釋放出游離態(tài)的GCs。使用最多的是β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶等。

Yang等叫利用酶水解提取肌肉(豬肉、牛肉和蝦)、牛奶和肝臟中的50種同化激素(包括曲安西龍、潑尼松、可的松、氫化可的松、潑尼松龍、氟米松、醋酸氟氫可的松、甲潑尼龍、倍氯米松、地塞米松、曲安奈德、氟輕松、布地奈德、丙酸氯倍他索等GCs)。在5g樣品中加入10mL乙酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH5.2)，再加入100μL葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶，37℃過(guò)夜，甲醇提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)。方法的定量限(LOQ)為0.04～2.0μg/kg，平均回收率為76.9%～121.3%，變異系數(shù)(CV)為2.4%～21.2%。李存等口在豬肝臟樣品中加入50μL的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在10mL乙酸銨溶液中，40C下酶解2h。在0.75μg/kg、1.5μg/kg和2.0μg/kg添加水平下，樣品中地塞米松和倍他米松的回收率在97.3%～111%之間。韓立等利用酶水解提取動(dòng)物尿液樣品中潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、醋酸氟氫可的松、醋酸可的松和氫化可的松等9種GCs，準(zhǔn)確吸取尿液試樣5.0mL，置于50mL離心管內(nèi)，用乙酸調(diào)pH5.2，加入0.02mol/L乙酸銨緩沖液5.0mL，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50μL，渦旋混勻，于37℃±1℃避光振蕩16h。乙酸乙酯提取，HLB柱串聯(lián)氨基柱凈化，LC-MS/MS分析。方法的檢出限(LOD)為0.5ng/mL，LOQ為1.0ng/mL，回收率為55.0%～106.2%，批內(nèi)、批間CV均低于15.4%。

VanDenHauwe等使用蝸牛液(Helixpomatiajuice)水解牛肝臟樣品，建立了可以檢測(cè)11種GCs(倍他米松、地塞米松、氟米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、氟氫可的松、曲安西龍、曲安奈德、倍氯米松和可的松)的LC-MS/MS方法，并對(duì)酶水解的溫度、pH和水解時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，在pH5.2、40℃、時(shí)間不超過(guò)4h時(shí)，可以取得滿意的水解效果。

(2) 提取方法

GCs殘留分析主要采用液液萃取(LLE)的提取方法。近年來(lái)，一些新的提取技術(shù)，如加壓溶劑萃取(PLE)、超聲輔助萃取(UAE)、固相微萃取(SPME)等也開(kāi)始應(yīng)用到GCs殘留的提取中。

1) 液液萃取(liquidliquidextraction，LLE)

LLE是最為常用的GCs提取方法，提取溶劑主要包括甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙醚、乙酸乙酯以及緩沖溶液等。

牛晉陽(yáng)等建立了豬肉中GCs多殘留分析方法。樣品經(jīng)甲醇提取，免疫親和柱凈化后，采用LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)分析。GCs的線性范圍均為0.5～100μg/kg，低、中、高3種質(zhì)量濃度加標(biāo)回收率均為78%～101%，LOD為0.2～2μg/kg。崔曉亮等開(kāi)發(fā)了牛奶中12種GCs殘留的分析方法。試樣中加入pH5.20的醋酸鹽緩沖溶液和甲醇，超聲提取，去除部分蛋白質(zhì)，然后用正已烷脫脂，依次經(jīng)HLB柱、硅膠柱和氨基柱等固相萃取柱濃縮和凈化后，LC-MS/MS測(cè)定。該法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27μg/kg；添加水平為2ug/kg和0.4ug/kg時(shí)，加標(biāo)回收率為69.3%～94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.5%～16.7%。VandenHauwe等報(bào)道了檢測(cè)牛腎臟、肌肉和毛發(fā)中GCs的方法。樣品經(jīng)酶水解后，用甲醇提取，固相萃取柱凈化后用LC-MS/MS測(cè)定。方法性能指標(biāo)滿足殘留分析要求。徐錦忠等建立了雞肉和雞蛋中潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、氟氫可的松、甲基潑尼松、倍氯米松及氫化可的松多殘留檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，正已烷脫脂凈化后，進(jìn)行LC-MS/MS定性及定量分析。該方法的LOQ為0.5μg/kg；在0.5μg/kg、1.0μg/kg和5.0μg/kg濃度添加水平，平均回收率為73.4%～108.9%，RSD為3.4%～13.4%。Zhang等建立了檢測(cè)血漿中地塞米松和地塞米松磷酸鈉的分析方法。采用乙腈-甲醇混合溶液提取并沉淀蛋白，LC-MS/MS測(cè)定。該方法在0.5～500ug/L呈線性(r大于0.99)，日內(nèi)和日間的CV小于10%，LOQ為0.5ug/L。

李飛等建立了速凍調(diào)制肉制品中7種GCs(潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、氟氫可的松乙酸鹽、倍氯米松、氫化可的松)的殘留檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，過(guò)硅膠固相萃取柱凈化，最后用乙腈定容，LC-MS/MS測(cè)定。方法的LOD為0.2～1.0μg/kg，LOQ為0.5～2.0μg/kg；添加回收率范圍為85.0%～96.4%，RSD為2.3%～6.1%。Shearan等開(kāi)發(fā)了牛肉、腎臟、肝臟和脂肪組織中地塞米松的檢測(cè)方法。牛肉、腎臟、肝臟用乙酸乙酯提取，脂肪用乙醚提取，經(jīng)凈化后，用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)。該方法的LOD可達(dá)到0.01mg/kg。Mazzarino等通過(guò)調(diào)節(jié)pH后，采用甲基叔丁基醚提取尿液中的16種合成GCs，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定，方法LOD在1～50ng/mL之間。Earla等采用甲基叔丁基醚提取兔眼組織中的地塞米松和潑尼松龍，凈化后用LC-MS/MS測(cè)定。地塞米松和潑尼松龍的LOQ為2.7ng/mL和11.0ng/mL，日內(nèi)和日間精密度為13.3%和11.1%，準(zhǔn)確度為19.3%和12.5%。Zou等利用乙醚-環(huán)己烷混合溶液提取血漿中的倍他米松，在0.5mL血漿中加入3mL乙醚_環(huán)己烷(4+1，v/v)，渦動(dòng)混合3min，4000r/min離心10min，有機(jī)層氮?dú)獯蹈桑?50μL流動(dòng)相復(fù)溶，LC-MSMS分析。該方法的回收率為92.5%～106.5%，LOQ為0.1ng/mL。Salem等采用乙醚-環(huán)已烷提取血液中的倍他米松及其乙酸和磷酸酯，固相萃取凈化后，LC-MS/MS測(cè)定。倍他米松的LOD為0.50ng/mL，其乙酸酯的LOD為1.00ng/mL，在2.0～200.0ng/mL范圍呈良好線性。鄒曉春等0用乙酸鈉-乙酸緩沖溶液勻漿，超聲振蕩，對(duì)肉中5種GCs進(jìn)行提取，再用HLB固相萃取小柱凈化，LC-MS/MS測(cè)定。在不同濃度水平下各GCs的平均加標(biāo)回收率均在86.2%～102.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10.4%；LOD為0.026～0.093μg/kg，LOQ在0.087～0.31μg/kg之間。

2)加壓溶劑萃取(pressurized liquid extraction，PLE)

PLE是指在較高的溫度(50～200℃)和壓力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下，用溶劑萃取固體或半固體樣品的新穎的樣品前處理方法。與傳統(tǒng)提取方式相比，PLE速度快、溶劑用量少、萃取效率高、待測(cè)組分回收率好，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)安全操作。Chen等建立了牛、豬、羊可食組織中8種GCs(潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松和氟氫可的松)的測(cè)定方法。以正己烷-乙酸乙酯(50+50，v/v)為提取溶劑，在1500psi和50℃下進(jìn)行加壓溶劑萃取，再進(jìn)行LC-MS/MS分析。在0.5～6μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，方法回收率在70.1%～103.1%之間，LOQ在0.5～2μg/kg之間。

3)超聲輔助萃取(ultrasound-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)是萃取速度快，價(jià)格低廉、效率高。崔曉亮等利用UAE提取牛奶中的12種GCs。稱取5.0g均勻的牛奶試樣，置于50mL離心管中，加入10mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.2mol/L，pH5.20)和35mL甲醇，超聲振蕩5min，于0℃下10000r/min離心10min，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化，LC-MS/MS分析。該方法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27ug/kg，回收率為69.3%～94.3%，RSD為3.5%～16.7%。Caretti等采用三氟乙酸溶液在UAE條件下提取牛奶中的13種GCs，經(jīng)富集和凈化后，用LC-MS/MS測(cè)定，地塞米松-D4為內(nèi)標(biāo)定量。方法回收率超過(guò)70%，日內(nèi)精密度小于12%。

4)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME是在固相萃取技術(shù).上發(fā)展起來(lái)的一種微萃取分離技術(shù)，是一種集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體的無(wú)溶劑樣品微萃取新技術(shù)。與固相萃取技術(shù)相比，SPME操作更簡(jiǎn)單，攜帶更方便，操作費(fèi)用也更加低廉；另外，克服了固相萃取回收率低、吸附劑孔道易堵塞的缺點(diǎn)。Ebrahimzadeh等報(bào)道了采用基于載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的三相中空纖維微萃取技術(shù)提取牛奶、血清中地塞米松磷酸鈉的方法。以含有5% (w/v) Aliquate-336的正辛醇作為載體，將地塞米松磷酸鈉從7.5mL pH3酸性溶液(源相)萃取到有機(jī)相中，并含浸在中空纖維的孔中，最后再用24uL pH9.5位于中空纖維內(nèi)腔里面(接收相)的堿性溶液萃取。提取基于從源相到接收相抗衡離子的梯度而發(fā)生。作者對(duì)影響提取效率的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，預(yù)濃縮因子為276，LOD為0.2μg/L，線性范圍為1～1000μg/L，RSD小于7.2%。

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